穿山甲(中药名)为鳞鲤科动物穿山甲的鳞甲,具有活血消症、通经下乳、消肿排脓的功效,用于治疗乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛等症[1],现代医学研究发现穿山甲对恶性肿瘤有一定程度的治疗效果[2,3]。穿山甲的传统动物基源仅限于中华穿山甲(Manispentadactyla)(也称穿山甲)。中华穿山甲为国家一级保护动物,野生数量极少,人工饲养技术尚不成熟,致使穿山甲药用资源匮乏,市场价格大幅增长[4]。为此,多种其他穿山甲属物种的穿山甲大量充斥市场,包括马来穿山甲、印度穿山甲、树穿山甲和南非穿山甲[5,6],严重影响了穿山甲临床用药的科学性和准确性,因此,明确穿山甲的动物基源非常必要。另外,在实际生产中,会根据经验对穿山甲进行等级分类,但其量化的分类标准一直空缺,且尚未见到相关研究。

穿山甲主要成分为角蛋白,同时含有硬脂酸、胆固醇等脂溶性成分和Si、Al等微量元素[7,8]。刘逊等[9]同时运用性状鉴别分析、基于胆固醇的薄层色谱分析以及以环二肽为特征指标的质谱分析,对不同基源穿山甲炮制品进行鉴别。谭永梅等[10]以薄层色谱法对比分析了穿山甲中的氨基酸成分。刘潇潇等[11]采用液相色谱-质谱联用,分析不同基源穿山甲中的特征肽段。其中,性状鉴别在针对非典型甲片或是破碎甲片时,种间分辨能力有限;薄层色谱分辨率低,而质谱成本高难以普及。另外,胆固醇或是过度分解的氨基酸并不能代表穿山甲专属特征,而少量的肽段也不足以反映穿山甲的整体轮廓。部分学者提出利用特异性DNA条码追踪鉴定穿山甲基源[12,13],但其繁杂的DNA提取及分析过程并不适合作为中药质量监测的常规手段。中药指纹图谱能够全面综合地反映中药化学组成的整体轮廓,体现中药多成分协同作用的基本特性,已成为中药来源和品质研究的重要手段[14,15]。在具体应用时,相似度评价是最基本和最简单的反映指纹谱相关性的数据分析方法。但在进行小类别分析时,基于统计学理论的判别分析有更高的数据处理能力,已广泛应用于天然产物的分类鉴别[16-19]。

本文同时收集了不同等级的中华穿山甲及多种其他基源的穿山甲,拟通过建立穿山甲的色谱指纹谱,结合相似度评价和判别分析,探讨其在等级及基源鉴别方面的可行性,为提高其临床用药科学性和准确性提供新的思路。

1 实验部分

1.1 试剂、仪器与材料

Waters Alliance高效液相色谱仪(2695梯度泵,2998二极管阵列检测器,自动进样器,柱恒温系统,Empower色谱工作站)。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸标准品均为分析标准品(≥98%),来自上海源叶生物科技有限公司。

乙腈(色谱纯,Meryer),三氟乙酸(色谱纯,Sigma-Aldrich),实验用水为Milli-Q纯水系统生成;其余试剂均为分析纯。

本研究共收集了不同等级的中华穿山甲24批,其他种属穿山甲4批,甲片具体信息见表1,所有甲片均来自北京三和药业。

表 1甲片批号、基源及等级Table 1Batch numbers, base resources andquality grades of scalesBatch No.Base resourceQuality gradeA101Manis pentadactyla (中华穿山甲)First-classA102Manis pentadactylaFirst-classA103Manis pentadactylaFirst-classB101Manis pentadactylaFirst-classB102Manis pentadactylaFirst-classB103Manis pentadactylaFirst-classS101Manis pentadactylaFirst-classS102Manis pentadactylaFirst-classS103Manis pentadactylaFirst-classS104Manis pentadactylaFirst-classS105Manis pentadactylaFirst-classS106Manis pentadactylaFirst-classAT01Manis pentadactylaGeneralAT02Manis pentadactylaGeneralAT03Manis pentadactylaGeneralBT01Manis pentadactylaGeneralBT02Manis pentadactylaGeneralBT03Manis pentadactylaGeneralST01Manis pentadactylaGeneralST02Manis pentadactylaGeneralST03Manis pentadactylaGeneralST04Manis pentadactylaGeneralST05Manis pentadactylaGeneralST06Manis pentadactylaGeneralNF01Manis temminckii (南非穿山甲)S01Manis tricuspis (树穿山甲)YD01Manis crassicaudata (印度穿山甲)ML01Manis javanica (马来穿山甲)

1.2 供试液的制备

取穿山甲,捣碎打粉过3号筛。精密称取甲片粉末2 g,置于125 mL具塞锥形瓶中,加入1 mol/L HCl 30 mL, 100 ℃条件下加热回流1 h,放冷,加入1 mol/L HCl补足减失的重量,摇匀,取上清液过0.45 μm孔径的聚醚砜滤膜,续滤液即为供试品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱为Waters Symmetry 300 C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,沃特世科技(上海)有限公司),流动相A为0.1%(v/v)三氟乙酸/水,流动相B为0.1%(v/v)三氟乙酸/乙腈,流速为1 mL/min,柱温为30 ℃,洗脱梯度:0～50 min, 0～30%B; 50～51 min, 30%B～90%B; 51～60 min, 90%B。紫外检测波长为280 nm。进样量为10 μL。

1.4 数据分析

1.4.1相似度评价